芳香族化合物是一类典型的有机污染物,在环境中分布广泛。该类化合物能够通过多种途径进入环境,且具有半衰期长、化学结构多样、毒性高等特点,能够被生物吸收富集并通过食物链传递,威胁人类健康与生态环境安全。如何高效安全地消除这些有机污染物成为人们日益关注的焦点。环境微生物(细菌、真菌、藻类)能够依靠体内酶系统代谢天然或合成的芳香族化合物,是芳香族化合物生物地球化学循环的重要驱动者。Rieske型芳香环双加氧酶能够催化芳香环特定位置的双羟基化反应,生成对应的顺式二氢二醇或二醇羧酸,从而降解芳香族化合物。有关Rieske型芳香环双加氧酶的研究多集中在新型双加氧酶的分离纯化、晶体结构、催化机制、蛋白质工程等方面,有效促进了该类酶在生物修复以及化学合成等领域的应用。该类酶具有催化化学反应多样性、高度立体选择性等特点,具有非生物催化剂无法比拟的优势,并在手性中间产物合成中发挥着巨大的作用,有望被开发为高效绿色催化剂。
Rieske型芳香环双加氧酶能够催化包括羟基化、环氧化、去甲基化、去饱和、氯化等在内的多种化学反应,其生物学作用不仅仅局限于芳香族化合物的降解,而且还能参与一系列分解代谢与生物合成途径中的氧化转化。选择性氧化是催化领域的重要课题,目前基于重金属的催化剂既昂贵又不环保,因此寻找低廉环保、立体选择性和区域选择性高、催化高效的人工催化剂成为研究的热点。Rieske型芳香环双加氧酶本身具有天然的、无可比拟的高效催化能力,在开发能够氧化底物多样性且具有区域选择性和立体特异性的催化剂上拥有广阔的前景。为深入了解Rieske型芳香环双加氧酶的化学反应过程和选择性催化机理,本文对微生物Rieske型芳香环双加氧酶的分类、催化功能多样性、蛋白结构、催化机制以及蛋白质工程等方面的研究进行综述,期望为该类酶的进一步理论分析与实际应用提供借鉴。
1 Rieske型芳香环双加氧酶的分类
Rieske型芳香环双加氧酶是含有Rieske[2Fe-2S]中心的多组分酶系统,多数由末端氧化酶、还原酶和铁氧还原蛋白3部分组成。其中,末端氧化酶由α亚基或αβ亚基共同组成,均含有一个Rieske[2Fe-2S]中心和一个单核铁活性位点。还原酶组分是一种含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)的黄素蛋白,一些还原酶组分中同样含有[2Fe-2S]中心。铁氧还原蛋白是含有[Fe-S]中心的小型酸性蛋白,根据[Fe-S]中心铁硫原子的连接数目可分为[2Fe-2S]和[3Fe-4S]两类。最初,依据Rieske型芳香环双加氧酶的组分不同以及氧化还原中心性质差异,将双加氧酶分为三大类。然而随着更多新型加氧酶的发现,该静态分类系统存在着一定的局限性。Kweon等基于多组分酶系统,将加氧酶作为一个整体进行分析,提出一个较为完善的新型动态分类系统。他们首先根据氧化酶的α亚基或αβ亚基组成将其分为两类,并根据保守区序列的不同将还原酶分为GR型、FNRC型、FNRN型3类,将铁氧还原蛋白分为[2Fe-2S]和[3Fe-4S]两类,最后综合以上多组分的类别,将加氧酶共分为五大类:Ⅰ类是由氧化酶和FNRC型还原酶组成的双组分系统;Ⅱ类是由氧化酶和FNRN型还原酶组成的其他双组分系统;Ⅲ类是由氧化酶、FNRN型还原酶和[2Fe-2S]型铁氧还原蛋白组成的三组分系统;Ⅳ类是由氧化酶、GR型还原酶和[2Fe-2S]型铁氧还原蛋白组成的三组分系统;Ⅴ类是由氧化酶、GR型还原酶和[3Fe-4S]型铁氧还原蛋白组成的三组分系统。该分类系统能够反映新的序列信息以及加氧酶组分之间的相互作用,可用于不完全的加氧酶分类。
2 催化功能多样性
Rieske型芳香环双加氧酶能够催化多种反应,包括羟基化、环氧化、去饱和、氯化、脱烷基、去甲基化等(图1)。例如,萘双加氧酶不仅能够催化多种双环和三环的芳香族化合物双羟化反应生成对应的二氢二醇,而且能催化其他氧化反应,包括单羟化、去饱和、脱烷基化和亚砜化等。同属非血红素铁依赖型的Fe2+/α酮酸双加氧酶也能够以加氧的方式催化类黄酮进行环羟化、氧化、去饱和等反应。
3 蛋白结构
Kauppi等和Furusawa等通过X-射线衍射方式分别解析出来自Rhodococcus的萘双加氧酶和联苯双加氧酶的晶体结构。随后,来自Sphin-gomonas的环羟化双加氧酶和Sphingobium的联苯双加氧酶等的晶体结构也相继被表征。在芳香环双加氧酶中,对萘和联苯双加氧酶的研究较为深入,而这两种酶的晶体结构也是最早被解析出来的,为其他双加氧酶的三维结构研究提供了参考。联苯双加氧酶采用α3β3构型,为六聚体结构,呈蘑菇状。蘑菇的帽部由α亚基组成,茎部由β亚基组成。其整体结构以及各亚基的结构与萘双加氧酶(NDO)十分相似。
4 催化机制
目前对萘双加氧酶的催化机制研究较多,萘双加氧酶催化萘降解的初始反应,利用分子氧和NAD(P)H实现萘的顺式1,2-双羟基化。黄素蛋白还原酶与铁氧还原蛋白共同组成电子传递链,将来自NAD(P)H的电子转移到末端氧化酶的Rieske[2Fe-2S]中心,铁硫中心接收电子,并将电子传递给单核铁活性位点,该单核铁激活分子氧以插入底物的苯环当中。在没有铁氧还原蛋白的双加氧酶系统中,黄素蛋白还原酶自身存在着与铁氧还原蛋白相似的[2Fe-2S]中心,也能够起到电子传递的作用。铁氧还原蛋白分子质量小,方便移动,大大提高了电子的传递效率,因此双加氧酶系统的演化方向更倾向于铁氧还原蛋白的存在。
5 蛋白质工程
蛋白质工程已经被用来提高Rieske型芳香环双加氧酶的催化速率、底物特异性和立体选择性。依据目前对酶结构和功能的认识,设计改造双加氧酶是优化和提升微生物生物催化能力的有效手段。基于活性位点的定点诱变和基因重组技术可以获得更加高效降解芳香族化合物的双加氧酶突变体。Barriault等已经证明联苯双加氧酶α亚基中氨基酸与底物识别有关,定点诱变α亚基中氨基酸,发现部分氨基酸的取代能够改变酶对底物的特异性或提高酶的催化效率。这些氨基酸的位置靠近单核铁活性中心,可能在酶的催化活性中起一定的作用。对Burkholderia2,4-二硝基甲苯双加氧酶(DDO)α亚基的I204位点饱和突变,突变体DDO提高了对2,4-和2,6-对二硝基甲苯的氧化能力。Bernath-Levin等通过多种蛋白质工程技术得到硝基苯双加氧酶突变体,其催化能力是野生型的3倍。突变体主要通过增大底物结合口袋空间和改变底物结合模式的方式提高酶的活性。
6 应用
芳香族化合物在自然环境中广泛存在,且对生物安全存在一定的危害,如何从环境中有效地消除这些化合物备受关注。微生物利用体内Rieske型芳香环双加氧酶降解芳香族有机污染物是环境微生物修复的重要过程[49]。Rieske型芳香环双加氧酶具有宽泛的底物特异性,能催化多种底物的立体选择性反应,这些特性使它们成为化学工业和医药领域重要手性化合物的合成催化剂,也为研发高效污染物微生物修复技术提供关键基础信息。Narancic等在新分离出的PseudomonasTN301中发现,邻苯二酚在多种邻苯二酚双加氧酶的作用下经连续分解,最后进入三羧酸循环转化为二氧化碳和水。
刘如洋将芳香环羟化双加氧酶的编码基因通过基因重组的方式整合到SWH-2菌株上,能够提高该菌对菲的降解能力,同时可将该菌应用于石油污染土壤的生物修复。高纯度手性化合物作为药物中间体在医药领域需求旺盛,而传统化学合成法不具备酶法立体选择性特征,较难获得手性纯化合物,生产成本昂贵。双加氧酶羟基化反应主要产生顺式二氢二醇中间体,该中间体可用于合成手性化合物。Janna等利用Co-mamonassp.硝基苯双加氧酶突变体能够氧化硫代苯甲醚、对甲苯异氰酸酯等硫化物的能力,合成手性亚砜。尽管这些酶是非常有前途的生物催化剂,但是它们对NAD(P)H的依赖性、多组分性质以及在非细胞系统中的固有不稳定性阻碍其实际应用,目前大多数利用Rieske型芳香环双加氧酶合成化学品的应用主要依靠全细胞催化。
7 展望
Rieske型芳香环双加氧酶来源丰富,是一类广泛存在的多组分酶,其介导的催化反应不仅是有机污染物降解的重要途径,也可用于生产制备重要手性化合物中间体。目前关于酶的组分、晶体机构和催化原理已有所了解,但是仍有许多细节值得深入研究。例如酶组分之间的相互作用、电子传递过程中活性位点的铁离子络合物的变化,以及不同氨基酸残基与底物如何相互作用从而影响酶的特异性等。基因组学的飞速发展使得更多的双加氧酶家族成员被发现,极大地扩展了该类型酶的底物谱与催化反应范围,为更多的化学反应进程研究提供了丰富资源。目前基于计算模拟和分子对接等技术,双加氧酶的催化特性与底物范围研究取得一定的进展,但是在氧化过程中所产生的反应中间体的性质仍有待明确和充分表征。Sutherlin等研究发现,Rieske型芳香环双加氧酶催化反应中存在一种高自旋的FeⅢ过氧化物中间体,而定义这种中间产物的结构对于理解该类酶的化学反应是至关重要的。
未来有关Rieske型芳香环双加氧酶的研究工作不再局限于芳香烃有机污染物的降解,而是基于催化反应的基础研究转向重要手性中间产物的合成。但是该酶系统的多组分复杂性、酶的不稳定性、[2Fe-2S]中心的氧敏感性以及对昂贵的NAD(P)H的共底物需求都给酶促反应带来了巨大的挑战。然而Rieske型芳香环双加氧酶在环境和化学工业领域的巨大应用潜力依然不容忽视,通过蛋白质工程技术优化和改造酶的功能特性,提高其生物催化活性,开发出适用于多种氧化反应的、高效、环保、廉价的生物催化剂,仍是未来发展的趋势。
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