1 研究背景
中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)由脑和脊髓组成，接受全身各处传入的信息，经过整合加工，支配与控制机体行为。当CNS发生病变时，神经递质信号传导受阻，导致一系列CNS相关疾病的发生，如精神疾病和神经退行性疾病等[1]。
研究发现，单胺氧化酶(monoamineoxida-ses,MAOs)主要分布在线粒体外膜上，是神经递质代谢中最重要的功能型蛋白酶，催化5-羟色胺、多巴胺、苯乙胺等单胺类神经递质的氧化脱氨，对维持CNS中单胺类神经递质传递的稳态起着关键作用[2]。MAOs基于代谢底物的不同，分为MAO-A和MAO-B两种亚型(Fig.1)[3]，MAO-A对5-羟色胺和去甲肾上腺素有很高的亲和力;MAO-B能催化多巴胺和苯乙胺[4-5]。MAOs表达异常(过高或过低)会打破CNS中单胺类物质的动态平衡，进而引发多种神经系统疾病。MAO-A表达异常与精神疾病和精神系统肿瘤有关，如精神分裂症、抑郁症和胶质细胞瘤;MAO-B过表达则与神经退行性疾病有着密切的联系，如帕金森病(Parkinson'sDisease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)等。
几十年来，随着对MAOs的深入研究，科学工作者发现通过药物抑制MAOs的活性能够改善病人的症状，并已开发了多种MAOs抑制剂药物。目前，FDA批准治疗精神疾病和神经退行性疾病的小分子药物有MAO-A抑制剂氯吉灵(clorgy-line,CL)，MAO-B抑制剂巴吉林(pargyline,PA)、雷沙吉兰(rasagiline,RA)、司来吉兰(selegiline,SE)等[4-6]，但这些抑制剂药物都有不同程度的毒副作用，且随着服药期增长，病人出现对药物敏感度下降的“剂末现象”和“开关现象”，无法从根源上解决精神性和神经退行性疾病问题。因此，设计特异性检测MAO-A/B活性的荧光探针，实时动态监测评估病人用药前后及用药过程中MAO-A/B的活性水平，对更好地理解MAOs的生理作用，指导临床用药并开发选择性强、毒副作用小的新型MAOs抑制剂具有重要意义。
针对MAO-A/B活性的特异性检测，本课题组基于“空间构型转换”概念，分别于2014/2020年设计了具有MAO-B/MAO-A特异性识别功能的双光子小分子荧光探针U1/F1(Fig.1)[4-5]，结合时空分辨率高、组织穿透性深及光漂白性低的双光子荧光显微镜(two-photonfluorescencemicroscopy,TPFM)，实现了探针在细胞和组织层面上特异性检测MAO-B/A的活性，助力于MAOs抑制剂药物和神经系统疾病标志物的研究工作，为神经系统疾病的诊疗提供科学性指导。
2 单胺氧化酶A/B亚型活性检测探针的设计思想及性质研究
MAO-B特异性双光子荧光探针U1，将MAOs反应性丙胺探头(Warhead,WH)和双光子荧光基团(fluorophore)2-甲基氨基-6-乙酰萘通过共价键连接，在MAO-B催化下，实现特定的荧光“Switch-ON”行为[4]，非荧光的U1转化为具有强荧光发射性能的Flu1(Fig.2A)。通过moleculardocking，可以理论模拟研究U1与MAO-A/B的结合方式，结果发现探针U1对MAO-B具有更好的亲和力(Fig.2B)。
U1只有在与MAO-B结合时WH朝向MAOs的活性位点辅酶FAD，而与MAO-A结合时相反。因此，可以利用“空间构型转换”的方法在U1结构的基础上设计一个新的MAO-A特异性双光子荧光探针，通过荧光信号增强的方式检测MAO-A的活性。将“WH”和“fluorophore”空间位置交换，保留U1中荧光团(萘)的结构[5]，将N,N-二甲基-2-萘胺与N-烷基化四氢吡啶结合，通过“瞬时共轭结构构建”的机理产生荧光信号变化[6-7]，并在MAO-A催化下实现了F1到FD1共轭结构的改变(Fig.2C)。根据moleculardocking结果(Fig.2D)，F1只有与MAO-A结合时，四氢吡啶上的氮原子才会指向辅酶FAD，从而完成酶催化氧化，得到具有荧光信号差异性变化的产物FD1，实现MAO-A的特异性荧光检测。
3 单胺氧化酶探针在神经系统疾病诊疗中的应用
在化学性质研究的基础上，我们将探针应用于人源细胞、动物及临床组织样品中，针对内源性MAO-A/B展开一系列活性检测研究，验证其在神经系统疾病诊疗中的应用方式和表现能力。
3.1MAOs探针在SH-SY5Y/HepG2细胞中的应用
人源性SH-SY5Y细胞和HepG2细胞是两种MAO-A/B表达背景存在差异的细胞系[8]，SH-SY5Y细胞具有MAO-A高丰度、MAO-B低丰度的特点，而HepG2细胞具有MAO-B高丰度、MAO-A低丰度的特点。针对MAO-B探针U1我们做了如下设计检测:首先，将U1分别与HepG2和SH-SY5Y细胞共同孵育，设置无抑制剂组、CL组(MAO-A抑制剂)和PA组(MAO-B抑制剂)，检测细胞裂解物中的荧光信号。结果表明，U1作用于HepG2细胞后信号显著增强，且与CL相比，PA可以更显著地降低此荧光强度;而对照细胞SH-SY5Y裂解物在上述测试条件下未检测到任何背景荧光(Fig.4A)。表明即使在MAO-A高表达的细胞中，U1也具有极高的MAO-B选择性。接下来，我们在十种哺乳动物细胞中测试U1的细胞毒性大小，0~200μmol/L测试浓度范围未对其中八种细胞产生显著毒性，50μmol/L浓度对两种细胞的活力有显著影响(Fig.4B)。我们采用siRNA进一步干涉HepG2细胞的MAO-B基因表达，发现MAO-B敲低后的HepG2细胞与U1作用，未见显著荧光信号(Fig.4C)。最后，我们利用TPFM对HepG2细胞进行荧光成像(Fig.4D)，发现U1在活细胞中对MAO-B具有极强的荧光成像能力。上述结果表明，与Amplex试剂盒或其他基于抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)等常规MAOs检测方法不同[4]，U1是一种具有细胞渗透性、低毒的小分子荧光探针，能够对活细胞中内源性MAO-B进行高灵敏度的活性检测及细胞成像。
3.2MAOs探针在动物组织样品和临床样品中的应用
在细胞实验的基础上，我们进一步研究U1在1或12个月龄小鼠深层脑组织样品中的荧光成像能力(Fig.5A)。在120μm深度的中脑黑质致密部(SNpc)区域，12个月龄的小鼠较1月龄小鼠的脑组织切片TPFM荧光成像强度显著增加，且信号能够聚焦于MAO-B高表达的星形胶质细胞区域(与PD成像/诊断密切相关)，表明MAO-B活性具有随小鼠年龄增加而增强的特点，且PA能显著抑制U1产生的荧光信号。我们在人源样品中进一步验证U1性能。研究表明，PD患者体内MAO-B的活性显著高于正常人群[9-10]，我们采集三位PD患者(Fig.5B,P4/P5/P6)和三位正常人(与PD患者年龄相匹配)(Fig.5B,Ctrl4/5/6)的B淋巴细胞样品，与U1孵育后检测荧光强度，发现与正常组相比，PD患者B淋巴细胞样品的荧光强度显著增强。在上述人源样品中，对相同PD患者(Fig.5C,P1/P2/P3)和正常人(荧光强度取平均值)(Fig.5C,Ctrl)的成纤维细胞样品进行类似实验，发现与U1作用后，正常人和PD患者的成纤维细胞样品荧光强度无显著变化。上述结果表明，PD患者MAO-B活性的增强具有组织特异性，而检测外周血细胞中的MAO-B活性可作为一种可靠、简便、快捷的方法被用于PD临床诊断。目前，无论是在临床前还是PD治疗阶段，都没有一个可靠的生物标志物可用于疾病的快速诊断和监测，基于多巴胺的PET成像检测效果好，但成本高昂，需要高度专业的技能才能完成[11-12]。因此，MAO-B特异性探针U1有望成为一种经济且简便的PD标志物生化示踪剂，在扩大临床样本量的基础上对U1的检测效能进行可信性评估，开发以U1为核心的PD临床诊断、监测试剂盒，将为无创影像诊断领域打开新的前景。
4 总结与展望
综上所述，本课题组基于“空间构型转换”概念，成功设计开发了MAO-B特异性探针U1和MAO-A特异性探针F1，能够对MAOs两种亚型MAO-A/B的活性进行区分和生化检测(Fig.6)。结合TPFM成像手段，我们进一步实现了活细胞内MAO-A和MAO-B活性的实时动态监测。探针的双光子特性，使其在具有一定厚度的组织样品中也展现出优良的成像性能。这将为以PD和胶质瘤为代表的MAO-B/A相关疾病的发病机制研究、临床诊断监测及新药研发提供有效的工具和先进的手段，对神经系统疾病的预诊疗具有重要意义。